روش‌های فیزیکی انتقال ژن یا ترانسفکشن

در حالی که توجه زیادی به سیستم‌های انتقال غیر ویروسی و ویروسی شیمیایی برای انتقال اسیدهای نوکلئیک (انتقال ژن) به سلول‌ها شده است، روش‌های فیزیکی انتقال ژن غیرویروسی برای سلول‌هایی که به سختی ترانسفکت می‌شوند، نویدبخش است. روش‌های انتقال ژن فیزیکی سعی می‌کنند اسیدهای نوکلئیک را مستقیماً به سلول برسانند.

رویکردهای شیمیایی از ترکیبات مصنوعی یا طبیعی به عنوان حامل برای انتقال ژن به سلول استفاده می‌کنند. برخی از آنها برای سلول‌ها سمیت ایجاد می کنند. تکنیک‌های فیزیکی یا مکانیکی این مزیت را دارند که از ورود مواد خارجی، به عنوان مثال، مواد شیمیایی یا ویروس‌ها، به سلول‌ها یا بافت‌های هدف اجتناب می‌کنند و بنابراین یک رویکرد جایگزین هستند. انواع مختلف روش‌های فیزیکی تحویل ژن عبارتند از: میکرو تزریق، تفنگ ژن، الکتروپوریشن و سونوپوراسیون، هیدروپوریشن با تحویل هیدرودینامیکی، مگنتوفکشن و تابش لیزر ، که نیروی فیزیکی را به کار می‌گیرند که در غشاء سلول نفوذ می‌کند و انتقال ژن درون سلولی را تسهیل می‌کند.

میکروانجکشن (Microinjection)

یکی از پرکاربردترین روش‌های انتقال مستقیم، تزریق میکرو است که برای اولین بار حدود 30 سال پیش گزارش شد.

میکروپیپت‌های شیشه ای با نوک ظریف کمتر از 0.5 میکرومتر برای تزریق نمونه مورد نظر به هسته سلول یا سیتوپلاسم سلول‌های چسبنده استفاده می‌شود. ریزتزریق دارای مزایای بازده انتقال و نرخ بقای تا 100 درصد است، طیف گسترده‌ای از مولکول‌ها را می‌توان تزریق کرد، و حتی تزریق کل اندامک‌ها گزارش شده است. چرخه سلولی و شرایط کشت سلولی را می توان قبل، حین یا بعد از تزریق تغییر داد.

روش‌های فیزیکی انتقال ژن برای جلوگیری از عوارض مرتبط با استراتژی‌های ویروسی و شیمیایی انجام می‌شود. به طور خاص، استفاده از روش‌های بیولیستیک (Biolistic) انتقال ژن به دلیل کاربرد گسترده و سمیت کم آن است. انتقال ژن بیولیستیک سال‌هاست که عمدتاً برای مطالعه و تولید گیاهان تراریخته استفاده می‌شود.

میکرواینجکشن دارای معایبی است از جمله اینکه از نظر فنی بسیار سخت است. این امر مستلزم یک دوره آموزشی طولانی است تا زمانی که نتایج قابل تکرار به طور معمول به دست آید. یک اشکال دیگر روش‌های میکرواینجکشن کلاسیک این است که تنها چند سلول (100-200) را می‌توان در یک آزمایش تزریق کرد. همچنین محدودیتی برای انواع سلولی وجود دارد.

انتقال ژن بیولیستیک / بمباران میکروذرات / تفنگ ژنی:

اخیراً، بمباران ذرات میکرو به دلیل کاهش وابستگی به ویژگی‌های سلول هدف، به عنوان یک روش انتقال محبوب شده است. فناوری بیولیستیک در شرایط آزمایشگاهی منجر به ترانسفکشن کارآمد شده، حتی در سلول‌هایی که ترانسفکشن آنها دشوار است. این روش در طراحی دستگاه تفنگ ژنی مفید خواهد بود و بهبودهای بیشتری را در مطالعات ترانسفکشن in vitro و in vivo از جمله ژن درمانی و واکسیناسیون به ارمغان می‌آورد. برخی از سلول‌ها، بافت‌ها و اندامک‌های درون سلولی نسبت به DNA خارجی، به ویژه سلول های گیاهی نفوذ ناپذیر هستند.

تفنگ ژن بخشی از روش انتقال ژن به نام روش بیولیستیک (همچنین به عنوان بمباران بیوبالیستی یا ذرات شناخته می شود) است. در این روش DNA یا RNA به ذرات خنثی بیولوژیکی (مانند طلا یا تنگستن) می‌چسبد. با این روش، کمپلکس ذرات DNA در موقعیت خلاء در بالای بافت هدف قرار می‌گیرد و با شلیک قدرتمند DNA به طور موثر وارد سلول‌های هدف می شود. ذرات فلزی بدون پوشش نیز می‌توانند از طریق محلول حاوی DNA که سلول را احاطه کرده است، شلیک کنند و بدین ترتیب مواد ژنتیکی را برداشته و وارد سلول‌های زنده کنند. کارایی انتقال تفنگ ژنی می تواند به عوامل زیر بستگی داشته باشد: نوع سلول، وضعیت رشد سلول، محیط کشت، نوع مهمات تفنگ ژنی، تنظیمات تفنگ ژنی و تجربیات تجربی و غیره.

الکتروپوراسیون

رایج‌ترین روش انتقال ژن فیزیکی، الکتروپوریشن است. این به دلیل سرعت، هزینه کم و سادگی آن است، میدان‌های الکتریکی پالسی را می‌توان برای وارد کردن DNA به سلول‌های حیوانی، مخمر، گیاهی و باکتری‌ها استفاده کرد. عواملی که بر کارایی ترانسفکشن توسط الکتروپوراسیون تأثیر می گذارند: قدرت میدان الکتریکی اعمال شده، طول پالس الکتریکی، دما، ترکیب DNA، غلظت DNA و ترکیب یونی محیط ترانسفکشن و غیره.

الکتروپوراسیون کاربرد میدان‌های الکتریکی کنترل شده و پالسی در سیستم بیولوژیکی است. هنگامی که یک پالس الکتروپوریشن تحویل داده می‌شود، منافذی روی غشا سلولی تشکیل می‌شود. منافذ تشکیل شده از 40-120 نانومتر هستند. قبل از بسته شدن مجدد منافذ، مولکول‌های هدف وارد سلول‌ها می‌شوند. با بسته شدن مجدد منافذ، مولکول‌ها در داخل سلول ادغام می‌شوند. الکتروپوراسیون غشای سلولی به عنوان ابزاری در تزریق دارو و DNA به سلول استفاده می شود.

غشاء پلاسمایی سلول محتویات مولکولی سیتوپلاسم را از محیط خارجی آن جدا می‌کند. غشاء پلاسما از دو لایه فسفولیپید تشکیل شده است، فسفولیپید دارای یک سر آبگریز و یک سر آبدوست است، هر مولکول قطبی، از جمله DNA و پروتئین، قادر به عبور آزادانه از غشاء نیستند، اما، ماتریس لیپیدی می تواند توسط یک میدان الکتریکی خارجی قوی مختل شود که منجر به افزایش هدایت غشایی و نفوذپذیری انتشار می‌شود، این اثرات در نتیجه تشکیل منافذ آبی در غشا است. الکتروپوراسیون در نتیجه جهت گیری مجدد مولکول‌های لیپیدی غشای دولایه برای تشکیل منافذ آبدوست در غشاء اتفاق می‌افتد. شل شدن پالس خارجی منجر به جهت دهی مجدد مولکول‌های چربی به بسته شدن منافذ غشاء در عرض چند ثانیه می‌شود.

مراحل انتقال ژن با دستگاه الکتروپوریشن

1. سلول ها را در فاز لگاریتمی میانی تا اواخر رشد برداشت کنید.
2. در دور rpm2000 به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید.
3. سلول ها را مجدداً در محیط رشد یا بافر مخصوص الکتروپوریشن معلق کنید.
4. محلول حاوی سلول را به کووت الکتروپوریشن منتقل کنید و DNA را اضافه کنید.
5. تنظیمات دستگاه الکتروپوریشن با توجه با نوع سلول تنظیم کنید و پالس را اعمال کنید.
6. سلول های الکتروپور شده را به ظرف کشت منتقل کنید و سلول‌ها را کشت دهید.

در مطالعه‌ای روی انتقال ژن به  E. coli با الکتروپوریشن، 80 درصد سلول‌ها DNA خارجی دریافت کردند. مقدار DNA مورد نیاز کمتر از روش های دیگر است. این روش ممکن است در داخل بدن برای تزریق واکسن، درمان بیماری‌ها (الکتروکموتراپی) انجام شود.

شرکت پارس‌تراوا تولید کننده دستگاه الکتروپوریشن و کووت الکتروپوریشن می‌باشد، می‌توانید برای استعلام قیمت دستگاه الکتروپوریشن و کووت الکتروپوریشن به شماره ۰۹۰۲۴۰۵۱۸۶۲ تماس بگیرید.

سونوپوریشن (Sonoporation)

سونوپوریشن استفاده از امواج فراصوت با کمک میکروحباب‌های محصور شده (EMB) است که می تواند غشاء سلولی را به طور موقت باز کند و ماکرومولکول‌ها را به سلول‌ها برساند. اولتراسوند کارایی انتقال سلول‌های حیوانی، بافت‌های آزمایشگاهی و پروتوپلاست‌ها را افزایش می‌دهد. با این حال، گزارش شده است که اولتراسوند می‌تواند به سلول آسیب برساند و غشاء آن را به طور کامل بشکند. کاربرد آن در تحویل DNA از توانایی قابل توجه اولتراسوند برای تولید فعالیت کاویتاسیون بهره می برد. کاویتاسیون تشکیل و/یا فعالیت حباب‌های پر از گاز در محیطی است که در معرض امواج فراصوت قرار دارد.

دو نوع کاویتاسیون وجود دارد، اینرسی و غیراینرسی. حباب‌های گاز با هر اندازه‌ای در فشار کم منبسط می‌شوند و در فشار بالا منقبض می‌شوند. اگر نوسان حاصل در اندازه حباب نسبتاً پایدار باشد (قابل تکرار در بسیاری از چرخه ها)، کاویتاسیون را کاویتاسیون پایدار یا غیراینرسی می‌نامند. در هر صورت، غشاء سلولی برای مدت کوتاهی باز می‌شود و به مولکول‌های خارجی یا DNA اجازه می‌دهد تا وارد سلول‌ها شوند.

مزایا:

• در تئوری، سونوپوراسیون می‌تواند DNA یا RNA را به هر نوع سلولی انتقال بدهد.
• روش غیر تهاجمی است که نیازی به تماس مستقیم فیزیکی ندارد.
• می‌توان از آن در داخل بدن نیز استفاده کرد.

مضرات:

 بازده ترانسفکشن سونوپوراسیون در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی نسبتاً پایین بود.

تابش لیزر/عکس‌برداری در انتقال ژن

لیزرها برای ورود DNA خارجی به سلول‌های کشت‌شده کارآمد هستند. سلول‌ها پس از تابش لیزر دچار تغییر در نفوذپذیری غشاء پلاسمایی می‌شوند یا در محل تماس منافذی را در غشاء تشکیل می‌دهند. همچنین گزارش شد که حفره‌ای بر روی یک سلول کشت ‌شده توسط پرتو لیزر ایجاد شده که خود را در مدت زمان کوتاهی ترمیم می‌کند. این طول‌موج‌ها همگی برای ایجاد منافذ در غشاء پلاسمایی یا تغییر نفوذپذیری غشای پلاسمایی از طریق اثرات مختلف مانند گرما، جذب، اثرات فتوشیمیایی یا ایجاد گونه‌های فعال اکسیژن استفاده می‌شوند.

مزایای:

• تابش لیزر مزیت ترانسفکشن هدفمند را ارائه می دهد، که با روش‌های شیمیایی، ویروسی که تمام سلول‌های جمعیت نمونه را درمان می‌کنند، امکان پذیر نیست. در نتیجه، سلول های مورد نظر در یک جمعیت مختلط را می توان شناسایی و برای درمان هدف قرار داد.
• این روش همچنین امکان نفوذ مستقیم نه تنها غشاء پلاسمایی سلولی بلکه غشای هسته را نیز ارائه می‌دهد. این امر در ترانسفکشن سلول‌های با رشد آهسته و غیرقابل تقسیم یا رده‌های سلولی اولیه مانند نورون‌ها مهم است.

معایب:

• نرخ ترانسفکشن کم است.
• در نتیجه تکانه های زیاد که ترانسفکشن را افزایش می دهد، میزان مرگ و میر نیز به طور قابل توجهی افزایش می یابد.
• این روش برای استفاده بالینی محدود است، زیرا تمرکز انرژی الکتریکی دشوار است و بسیار مخرب است.

مگنتوفکشن (Magnetofection)

مگنتوفکشن روشی از ترانسفکشن (انتقال ژن) است که در آن اسیدهای نوکلئیک یا سایر ناقل ها با نانوذرات مغناطیسی پوشیده شده با مولکول‌های کاتیونی همراه می‌شوند. سپس کمپلکس‌های مولکولی به‌دست‌آمده به سمت سلول‌ها هدف قرار می‌گیرند و توسط یک میدان مغناطیسی مناسب پشتیبانی می‌شوند. نیروی مغناطیسی انتقال نانوذرات را تسریع می‌کند و زمان‌های فرآیند سریع را با نرخ انتقال به طور قابل توجهی بهبود می‌بخشد. ساختار و ساختار غشایی در مقایسه با سایر روش‌های انتقال ژن فیزیکی دست نخورده باقی می‌مانند. نانوذرات مغناطیسی از اکسید آهن ساخته شده‌اند که کاملاً زیست تخریب پذیر است و در دوزهای توصیه شده سمی نیست.

مزایای:

• زمان انکوباسیون مورد نیاز برای دستیابی به ترانسفکشن بالا، کوتاه است.
• امکان انتقال ژن به سلول‌های غیرمجاز، ترانسفکشن سخت، سلول‌های اولیه و سلول‌های غیرقابل تقسیم یا تقسیم آهسته وجود دارد.
• روش ارزان است.

ترکیب نانوذرات مغناطیسی به ناقل‌های ژنی از هر نوعی منجر به افزایش چشمگیر جذب این ناقل‌ها و راندمان انتقال می‌شود. این مزایا باعث می‌شود که مغناطیس به ابزاری ایده آل برای رویکردهای ژن درمانی ex vivo تبدیل شود. برای درمان‌های مبتنی بر ژن و اسید نوکلئیک in vivo، مگنتوفکشن ممکن است انتخاب خوبی باشد که در آن درمان موضعی مورد نیاز است.

هیدروپوریشن

هیدروپوریشن باعث انتقال هیدرودینامیکی DNA می‌شود بدین صورت که منافذ گذرا در غشای سلول باز شوند و اجازه ورود DNA به سیتوپلاسم را بدهند و عرض 10 دقیقه پس از تزریق بسته می‌شوند. بازده انتقال ژن این روش مبتنی بر هیدرودینامیک با اثر ترکیبی حجم زیاد و سرعت تزریق بالا تعیین می‌شود.

مزایا: ساده ترین و راحت ترین روش انتقال ژن in vivo است. راندمان هیدروپوراسیون نیز بالاست.

معایب: علاوه بر کبد، کاربرد آن در بافت های دیگر در گذشته به طور کامل بررسی نشده است. اخیراً از هیدروپوریشن در عضله و کلیه نیز استفاده می‌شود.

رفرنس:

Ding, Weimeng, et al. “Nanomaterial-assisted light-induced poration and transfection of mammalian cells.” Applications of Nanoscience in Photomedicine. Chandos Publishing, 2015. 331-376.‏

Das, A. K., Parul Gupta, and D. Chakraborty. “Physical methods of gene transfer: Kinetics of gene delivery into cells: A Review.” Agricultural Reviews 36.1 (2015): 61-66.

White, Kenneth E., Daniel L. Koller, and Tim Corbin. “Skeletal Genetics: From Gene Identification to Murine Models of Disease.” Basic and Applied Bone Biology. Academic Press, 2014. 149-171.

‏Krut, Z.; Gazit, D.; Gazit, Z.; Pelled, G. Applications of Ultrasound-Mediated Gene Delivery in Regenerative Medicine. Bioengineering 2022, 9, 190. https://doi.org/10.3390/bioengineering9050190

Mellott, Adam J., M. Laird Forrest, and Michael S. Detamore. “Physical non-viral gene delivery methods for tissue engineering.” Annals of biomedical engineering 41 (2013): 446-468.‏