طریقه انتقال ژن و ویرایش ژنوم به وسیله الکتروپوریشن
الکتروپوریشن یک روش جایگزین برای ویرایش ژن و انتقال به ژنوم استفاده می شود.
اگرچه الکتروپوریشن به طور سنتی برای رده های سلولی کشت شده استفاده می شود ، اما در انتقال ژن های ویرایش شده در زیگوتهای موش نیز موثر است. پروتکل الکتروپوریشن فقط به یک استریومیکروسکوپ ، یک الکتروپوریتور و یک کووت الکتروپوریشن نیاز دارد.
زیگوت ها در یک کووت یا روی یک اسلاید قرار می گیرند در حالی که در محیطی حاوی معرفهای ویرایش ژنوم معلق می شوند. الکتروپریتور پالس های جریان الکتریکی را از طریق الکترودها هدایت می کند تا میکرو حفره های موقت در زونوپلوسیدا (ZP) و غشای پلاسمایی ایجاد شود تا حرکت مواد ویرایش ژنوم به داخل زیگوت ها امکان پذیر شود.
این اتفاق به وسیله ی الکتروپوریشن نسبت به MI بطور قابل توجهی تسریع می شود. در هر نقطه از 35 تا 100 زیگوت را می توان به طور همزمان الکتروپور کرد.
با توجه به مقیاس پذیری بالقوه و سهولت استفاده از الکتروپوریشن ، این روش پتانسیل تبدیل شدن به بستری برای امکان ویرایش ژنوم با توان بالا در گونه های دام است. با این حال ، بهینه سازی خاص پارامترهای الکتروپوریشن برای دستیابی به ویرایش، میزان بقا و کارآمد زیگوت ها ضروری است.
یکی از اولین مطالعات منتشر شده در مورد الکتروپوریشن زیگوت های موش به این نتیجه رسید که ولتاژ ، طول پالس و غلظت کلاستر منظم پالیندرومیک (CRISPR) ، اندونوکلئاز Cas9 (Cas9)/RNA و (sgRNA) همگی نقش مهمی در بقای جنین و کارآیی جهش ها دارند.
ولتاژهای بالاتر ، طول پالس طولانی تر و غلظت بالاتر Cas9/sgRNA همه با افزایش بازده ویرایش ارتباط مثبت دارند ، اما با زنده ماندن جنین ارتباط منفی دارد. هنگام بهینه سازی شرایط الکتروپوریشن ، نیاز به ایجاد تعادل بین میزان جهش و زنده ماندن جنین وجود دارد. کارآمدترین پارامترها برای الکتروپوریشن بستگی زیادی به گونه های زیگوت و نوع ویرایش دارد (ناک اوت در مقابل ناک اوت) ، بنابراین لازم است پارامترهای هریک از این متغیرها را به حداکثر برسانیم تا نسل زنده را به حداکثر برسانیم.
هنگام بهینه سازی شرایط الکتروپوریشن چندین متغیر باید در نظر گرفته شود از جمله ولتاژ مورد استفاده ، چند بار آن ولتاژ (تعداد پالس) و طول (عرض) پالس اعمال می شود. در الکتروپوریشن جنینها ، فقط پالسهای موج مربع گزارش شده است. یک پالس “سوراخ کننده” که یک پالس ولتاژ مختصر متوسط است که برای باز کردن منافذ در غشای سلولی طراحی شده است و پالس “انتقال” ولتاژ پایین که برای انتقال مولکولهای اسید نوکلئیک با بار منفی به سلولها و هسته ها طراحی شده است.
الکتروپوریشن پالس ترکیبی از پالس های متناوب و انتقال دهنده استفاده می کند و می تواند انتقال سلول های یوکاریوتی را با DNA پلاسمید یا siRNA افزایش دهد. با این حال ، همه الکتروپریتورها هر دو نوع پالس را ندارند و اغلب فقط ولتاژ تخلیه مورد استفاده قرار می گیرد و در بسیاری از مقالات گزارش می شود.
